用于从淀粉和无机氨可持续生物生产工业葡萄糖胺的人工体外合成酶生物系统
工业葡萄糖是一种天然存在的生物活性氨基单糖，广泛用于食品、化妆品和制药行业。传统上通过甲壳素的酸/酶水解生产，但存在个体过敏、环境污染严重和产量低的风险。*近出现的一种生产氨基葡萄糖的方法是使用经过处理的微生物进行微生物发酵以生产 N-乙酰氨基葡萄糖，然后将其水解为氨基葡萄糖。但是，这种方法不能一锅生产氨基葡萄糖，并且受到酸水解过程引起的环境问题的影响。为了生产具有成本竞争力且环境可持续的氨基葡萄糖，创建一个人工体外酶生物合成系统，该系统由五种*联酶组成，这些酶可以从麦芽糊精和无机氨中生物生产氨基葡萄糖。作者在 pH 值、酶组成、磷酸盐浓度和氨浓度方面*化了该合酶的生物系统。*化后的酶混合物将 10 g/L 麦芽糖糊精转化为 7.9 g/L 葡萄糖胺，转化效率为 75.8% mol/mol 葡萄糖当量麦芽糊精。此外，这种非发酵生物制造生物系统被简单地放大以研究该行业的潜力，从 50 g/L 的麦芽糊精中获得 23.7 g/L 的氨基葡萄糖。这种体外酶平台为氨基葡萄糖生产提供了生物精炼技术，具有可预测的安全性、环境友好性和可持续性，因此是工业规模氨基葡萄糖生产的有前途的替代品。
GlcN（氨基葡萄糖，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖）合成酶生物系统的体外设计
体外合成酶生物系统旨在通过包括磷酸化、异构化、氨化和去磷酸化在内的一系列生物催化作用将淀粉和无机氨转化为 GlcN。生物系统由五个连续的酶促反应组成：（1）在无机磷酸盐存在下，淀粉被αGP磷酸化产生G1P；（2）G1P被PGM转化为G6P；（3）G6P被PGI F6P转化；（4）以游离氨为氨基供体，F6P被GlmD转化为GlcN6P；（5）GlcN6P被GlmP转化为GlcN6P 被GlmP去磷酸化和磷酸化。无机磷酸盐可以在槽中的反应 1 和反应 5 之间循环。反应F6P向GlcN6P的转化可以通过使用昂贵的谷氨酰胺作为氨基供体谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶（GlmS）或使用无机氨作为氨基供体GlmD来实现，但后者的研究是促进产业规模化的**并避免产生副产品。热力学的缺点是GlmP催化的*后一步的ΔG'值为17.2 kJ/mol，计算整个反应的ΔG'为22 kJ/mol。图B显示了产生的GlcN的产率。富含淀粉和无机氨。
酶的选择和制备
GlmP 的底物特异性是该体外合成酶生物系统中高产量的重要决定因素，该系统将淀粉和无机氨转化为 GlcN。大多数磷酸酶具有高水平的底物环境，本研究设计的反应体系含有更多的糖磷酸中间体，如G1P、G6P、F6P和GlcN6P，迫切需要一种具有高去磷酸化的GlmP。比 F6P 更活跃。经过文献检索，芽孢杆菌GlmP相对于GlcN6P（552M-1s-1）的催化效率（kcat/Km）是G6P（26.7M-1s-1）和F6P（8.3M-1s）的20.7倍和66.5倍. -1)，分别。这是有史以来*高的 GlcN6P 特异性去磷酸化活性。因此，本研究选用芽孢杆菌GlmP，其比活性为3 U/mg anti-GlcN6P、0.3 U/mg anti-G6P、0.033 U/mg anti-F6P，37°C下G1P活性可忽略不计。 ..这些酶包括 E.coli αGP、Thermofibrio 酵母 PGM 和 Thermofibrio 酵母 PGI，在 37°C 下的比活性分别为 5.6、20 和 396 U/mg。由于一些GlmDs，如大肠杆菌GlmD，需要被N-乙酰谷氨酰胺6-磷酸变构激活，所以选择枯草芽孢杆菌蛋白酶灭活因子GlmD在37℃时比活为4.5U/mg。如图 C 所示，这五种酶通常在大肠杆菌中表达，并根据 SDS-PAGE 几乎均匀地纯化。
氨基葡萄糖生产的概念验证分析
使用安捷伦 ZORBAX SB-C18 色谱柱的高效液相色谱法通过 OPA 柱前衍生化对 GlcN 的浓度进行定量。标准气相色谱峰样品洗脱成两个相邻的重叠峰，保留时间为 9.7。 ..这两个峰的高度与 GlcN 的浓度成正比，使用保留时间为 9.7 分钟的较高峰来确定 GlcN 的浓度。在这个体外生物系统中，GlcN6P、(NH4)2SO4 和衍生试剂 OPA 分别在 7.1、15.4 和 21.05 分钟处出现响应峰。 OPA 衍生化方法未检测到麦芽糊精（淀粉衍生物）、葡萄糖和其他中间体（G1P、G6P 和 F6P）的响应信号。因此，OPA衍生法可用于GlcN的定量分析。淀粉用作生产 GlcN 的底物。如前所述，为了获得高产率，淀粉首先通过 IA 分解成麦芽糊精。由于αGP在淀粉分叉之前不能从几个葡萄糖单元产生G1P，因此需要使用IA来切割支链淀粉的α-1,6-糖苷键并释放未支化的麦芽糖糊精。然后反应混合物是 100 mM HEPES 缓冲液 (pH 7.0)、10 mM 磷酸盐、10 g/LIA 处理的麦芽糊精（确定为 59.7 mM 葡萄糖当量）、100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 、5 mM硫酸镁和包括 1U /。用于进行概念验证实验以在 37°C 下生产 GlcN 的五种*联酶中每一种的 ML。通过在不同时间点将反应溶液应用于 HPLC 来检测 GlcN。如图 B 所示，9.6 到 10.2 分钟的峰形与 GlcN 标准品的峰形相同，表明 GlcN 通常是通过该生物系统由麦芽糊精和无机氨合成的。随着反应的进行，产生的气相色谱峰的高度逐渐增加（图B）。根据峰高计算，GlcN的浓度在10小时逐渐增加到21.7 mM（3.88 g/L），收率稳定在36.3%（图C）。 2 小时后，残留麦芽糖糊精迅速降* 33.7 mM（葡萄糖当量），*终在 20 小时内达到 24.7 mM（葡萄糖当量）。从第 10 小时起，葡萄糖一直保持在 5.8 mM（1.04 g/L）的浓度。工业葡萄糖的存在是由于 GlmP 对 G6P 的无效活性。 G6P 水平在 2 小时时达到高水平，并随着反应的进行而降低。 G1P 和 F6P 的浓度在整个反应过程中可以忽略不计（图 C）。 GlcN6P 的浓度在 2 小时时达到*大约 1 mM，然后逐渐降低*可忽略不计的值。该验证实验表明，所设计的体外酶生物系统可以在一个锅中安全、可持续地从淀粉和无机氨合成GlcN。
*化反应条件，提高产品收率
由于实验中GlcN的产物收率较低，因此*化了体外生物体系的反应条件以获得较高的GlcN收率。根据图 C 中的结果，当使用 10 g/L 麦芽糊精作为底物时，*化反应时间设置为 10 小时。首先，*化初始 pH 值。如图 3A 所示，将初始反应的 pH 从 7.0 更改为 8.0 会降低副产物的葡萄糖浓度，并且在 pH 7.5 时，GlcN 的浓度高于在 pH 7.0 和 8.0 时的浓度。因此，GlcN 生产的初始反应 pH 值设置为 7.5。
在 7.5 的*佳 pH 值下*化酶剂量。为了*化 αGP 加载（图 3B），当 PGI、PGM、GlmD 和 GlmP 以 1 U/mL 加载时，随着 αGP 从 0.25 增加到 2 U/mL，GlcN 浓度迅速增加。*高值为25.8mM值。因此，αGP的*佳用量为2 U/mL。当使用 2 U/mL αGP、1 U/mL PGI、1 U/mL GlmD、1 U/mL GlmP 和 0.25-4 U/mL PGM 时，在 2 U/mL PGM 处获得 GlcN 的*高浓度。小组NS）。同样，PGI、GlmD和GlmP的*佳酶剂量值分别为3 U/mL、2 U/mL和2 U/mL（图DF）。结果表明，10 g/L 麦芽糊精的*佳酶载量分别为 2、2、3、2 和 2 U/mL。
其次，在*佳 pH 值和酶浓度下*化磷酸盐和氨浓度。麦芽糊精需要磷酸化，这会在高浓度下沉淀 Mg2+，导致依赖 Mg2+ 的酶失活并降低产品产量。对于 10 g/L 麦芽糖糊精，*佳磷酸盐浓度为 20 mM，如图 G 所示。在 GlcN 合成生物系统中，氨作为 GlmD 催化反应的氨基供体。为了找到该体外酶生物系统的*佳氨浓度，在*佳 pH、酶剂量和磷酸盐浓度下进行 GlcN 生产，同时将 (NH4) 2SO4 的浓度从 25 mM 改为 250 mM。我查了一下。如图 3H 所示，GlcN 的浓度在 100 mM (NH4) 2SO4 时逐渐增加到 37.8 mM，然后随着 (NH4) 2SO4 浓度的进一步增加而稳定。综上所述，由 10 g/L IA 处理的麦芽糊精合成 GlcN 的*佳条件是 100 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5）、20 mM 磷酸盐、100 mM (NH4) 2SO4、2 U/mL αGP、2 U/mL PGM 、3 U/mL PGI、2 U/mL GlmD 和 2 U/mL Glm P。
